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茶多酚氧化酶酶学性质研究
赵淑娟王坤波傅冬和李园莉雷玉国李勤
(湖南农业大学a园艺园林学院;b.茶学教育部重点实验室，湖南长沙410128)
摘要:采用柠檬酸一磷酸氢二钠缓冲液(PHS.6)匀浆浸提法和硫酸馁沉淀法，从茶鲜叶中提取多酚氧化酶，并通过分光光度法研究pH，温度，抑制剂对酶活性的影响.结果表明:以邻苯二酚为底物，茶多酚氧化酶PPo的最适pH为5.6，最适温度为50℃，亚硫酸钠、半胧氨酸和v-c为Po的抑制剂.关键词:茶;多酚氧化酶;抑制剂
中图分类号:5571.101文献标识码:A
0ntheenzymologlcalfeatureofPolyPhenol0x1dasefromtea
Abstract:lyPhenoloxidase(PPO)wasextractedfromtealeaveswithsodiumPhosPhatebufer(PHS.6)fractionatedwithsolida。oniumsulfate.SpectroPhotometermethodwasaPP1iedintheexperimenttostudythecharactorsofPP0fromtea，suchasProperPH，timumtemperatureandinhibitors.Theresultsshowedthatwhencatecholwasusedasenzymesubstrates，theProPerPHwass.6，theoPtimumtemperaturewas50℃，ascorbicacid，sodiumsulfite，L一cysteine，benzoic即idandcinnamicacidwerenhibitorsofP0fromtea.Diferentsubstrateshad
diferentefectsonPP0activity.
Keywords:tea;polyPhenoloxidase;inhibitor
茶多酚氧化酶(邻苯二酚氧化还原酶，po，E.c.1.10:31)是茶树体内的一种重要酶类，它对茶树的生长发育具有积极意义，在茶叶加工中占有极为重要的地位，其活性的高低也是决定茶树品种适制性的一个重要指标1].在茶叶加工过程中，茶多酚氧化酶的作用主要是促使儿茶素类物质氧化成邻酿进而形成茶黄素等氧化聚合物12].伴随着儿茶素等多酚类物质的氧化，氨基酸、胡萝卜素等香气前体物质发生偶联氧化，产生多种香气化合物，形成红茶的独特品质.有研究证明，茶黄素含量与红茶品质呈高度正相关，并具有良好的生理活性131.近代研究表明，茶黄素具有抑菌、抗炎、抗病毒、抗氧化、降脂等多种药理功能，并对动脉粥样硬化、高血压、龋齿等都有一定的防治效果叫].研究茶多酚氧化酶的生物学特性，是茶叶生化领域的一大热点.掌握多酚氧化酶的特性，可以为红茶加工过程中控制适度发酵及提高茶黄素的含量提供理论依据，丰富茶叶加工及生物化学理论.
1材料与方法
1.1材料
茶鲜叶储叶齐，采于长沙高桥茶园，储藏于一70℃冰柜中.
1.2方法
1.2.IPPO的提取
取509，一70℃茶鲜叶加人到30mL预冷的柠檬酸一磷酸氢二钠缓冲液(PHS.6)中，并加人109Pvpp和0.59琴c，在组织粉碎机中匀浆2次，每次2而n.匀浆物收集于大三角瓶中，于4℃冰箱中，静置浸提12h，其间振荡2次.将浸提后的酶液经4层纱布过滤后，在冷冻离心机中以4℃离心2次，每次20而n，转速分别为40(刃和9。叹川min，弃去沉淀，边搅拌边向上清液中加人固体硫酸按分级盐析，取30%一80%盐析沉淀物经pHS.6的柠檬酸一磷酸氢二钠缓冲液透析，即得到茶多酚氧化酶粗酶液.
1.2.ZPO活性测定及最佳反应条件的确定于37，C，pHS.6的条件下，用U琴2550分光光度计在460nm波长下检测酶活，单位时间内，单位体积酶液吸收值变化0.01定义为一个酶活单位.配制。。lmo讥柠檬酸磷酸缓冲液，在pH分别为4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0时，以rolnmo比邻苯二酚为底物测定多酚氧化酶的活性.配制0.lm。比pHS.6的柠檬酸磷酸缓冲液，分别在25，30，35，40，45，50，55，60，65，70，75，80℃条件下，以10Inlno比邻苯二酚为底物，测定多酚氧化酶的活性.以10Inlno比邻苯二酚为底物，在上述检测的最适pH及最适温度的条件下测定亚硫酸钠、半胧
氨酸和丫C对多酚氧化酶活性的影响.配制10rnJllo比邻苯二酚，50Inmo比焦性没食子酸，ZmoljLEGcg，Zrnmo比ECg，再用pH5.6的柠檬酸磷酸缓冲液调配成不同终浓度水平，测定米氏常数角n和最大反应速率竹nax.
2结果与分析
2.lpH对pPO活性的影响
以邻苯二酚为底物，于37℃条件下测定不同pH值时多酚氧化酶的活性，结果见图1.从图1可以看出，以邻苯二酚为底物，茶鲜叶中多酚氧化酶的最适pH约为5.6.当pH降至4.0时，酶活性为最高活性的68.5%;当pH升至8.0时，酶活性为最高活性的35.8%.毛清黎10]在研究红茶发酵中pH调控对多酚氧化酶活性及茶黄素形成的影响时，也发现在偏酸的条件下发酵有利于茶黄素的形成从而提高红茶品质.
图略
2.2温度对ppo活性的影响
以邻苯二酚为底物，pHS.6条件下测定不同温度对多酚氧化酶活性的影响，结果如图2.茶多酚氧化酶对温度很敏感，其最适温度为50℃.温度比最适温度低时，随着温度的升高，酶活性也升高，直至最适温度才表现最大活力，但是温度高于最适温度以上时酶活性呈直线下降，温度升至80℃时，茶多酚氧化酶的活性完全受到抑制.所以，调节反应温度可以有效提高多酚氧化酶活性.
图略
2.3亚硫酸钠、半肤氨酸和V一C对pPO活性的影响底物为rolnlno比邻苯二酚，在37℃，pHS.6时测定不同添加剂对多酚氧化酶的抑制作用，结果见图3，亚硫酸钠、半胧氨酸和v一C都对茶叶中的多酚氧化酶有强烈的抑制作用.当V一C浓度达到0.Znuno比，N屯503浓度达到。，3nlnoUL，半胧氨酸浓度达到0.4Inlno比，均能完全抑制茶多酚氧化酶的活性.
图略
.4不同底物对PO活性的影响
以不同底物测定酶促反应的动力学性质.根据中间复合物假说，在pHS.6，37℃条件下，测定了不同底物存在时的吸光值，采用Lineweaver-Burk双倒数法求得各底物的为n和Vhlax，结果见表1.
图略
从以上结果中可以看出，不同底物对茶多酚氧化酶的催化反应有不同的尤由和竹nax.4个底物中，茶多酚氧化酶的最佳底物是Ecg，其次是EGCg，焦性没食子酸和儿茶酚.但从反应速度来讲，儿茶酚的Vmax最大，其余大小依次是儿茶酚，Ecg，Eocg，焦性没食子酸.
3讨论
PPO是一种含铜的蛋白质，其作用机制在于铜的氧化还原作用，在酸性环境中，酶中cu2+被解离出来，使酶失活，而在碱性环境中酶蛋白与cu2+脱离成为不溶性氢氧化铜，也能使酶失活fl‘].本试验以邻苯二酚为底物，茶鲜叶中多酚氧化酶的最适pH约为5.6.不处于最适pH条件下时，PPO都不能充分发挥其催化作用.因此，控制适宜的pH值能有效提高酶活性，有利于酶促反应的进行.同时，儿茶素的组成和温度等条件也对酶促反应影响较大，
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