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茯砖茶提取物的抑菌作用研究
余智勇，黄建安，杨明臻，欧阳梅，张?，傅冬和*
摘要：采用药敏纸片法、试管二倍稀释法测定了茯砖茶对大肠杆菌、链球菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏杆菌、枯草杆菌、巴氏杆菌等6种细菌的抑菌效果。结果表明，茯砖茶提取物对这6种菌都具有一定的抑制作用，其中对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制效果最好，对沙门菌和链球菌的抑制作用次之，对巴氏杆菌和枯草杆菌的抑制作用较差。
关键词：茯砖茶；药敏纸片法；试管二倍稀释法
StudyonAntimicrobialEffectofFuzhuanTeaExtracts
YuZhiyong,HuangJianan,YangMinzheng,OyangMei,ZhangYue,FuDong-he*
Abstract:Theuseofsensitivityfilterpapermethodandtest-tubetwicedilutionmethodofFuzhuanTeaontheantimicrobialeffectonEscherichiacoli,Streptococcus,Staphylococcusaureus,Salmonella,Bacillussubtilis,Pasteurella.TheresultsshowedthatFuzhuanTeaextractshaveinhibitiontothesixkindsofbacteria,inwhichEscherichiacoliandStaphylococcusaureusthebestinhibitoryeffect,SalmonellaandStreptococcusinhibitoryeffectofthesecond,BacillussubtilisandPasteurellatheinhibitioneffectofthethird.
Keywords:FuzhuanTea;meansofsensitivityfilterpaper;test-tubetwicedilutionmethod
茯砖茶属黑茶类，为一种后发酵茶。茯砖茶是一种古老茶品，也是一种边销茶，是青藏高原、蒙古高原以及丝绸之路两侧的少数民族人们日不可少的饮料[1]。本研究首次将茯砖茶提取物用于对人体常见致腹泻菌的抑制，并研究其抑菌效果，根据其抑菌效果探讨茯砖茶的药理功效，这对茯砖茶的综合利用具有重要的意义。
1材料与方法
1.1试验材料
采购于益阳茶厂的特级茯砖茶，粉碎后过20目筛，备用。
试验菌种：大肠杆菌（Escherichiacoli）、链球菌（Streptococcus）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）、沙门氏杆菌（Salmonella）、枯草杆菌（Bacillussubtilis）、巴氏杆菌（Pasteurella）（由湖南农业大学食品科技学院微生物研究室提供）。
1.2主要仪器与设备
WFZUA-2000紫外可见分光光度计、R-100旋转浓缩仪、HH数显恒温水浴锅、LS-B50L立式压力蒸汽灭菌器、SW-CJ-2D名牌之星双人单面净化工作台、ZD-85荣华气浴恒温振荡器、WFJ7200型可见分光光度计。
接种环、酒精灯、培养皿、微量注射器、蒸发皿、常规玻璃仪器、抽滤装置等。
1.3试验方法
1.3.1茯砖茶水浸提物的制备[3]
将茯砖茶粉碎，按1?15的茶水比用沸水浸提茶叶30min，两层纱布过滤，滤液经5000rpm离心后减压浓缩，制成含茯砖茶1g/mL的提取液，放入高压蒸气灭菌锅中，经121.3℃，15～20min高压灭菌后，取出备用。
1.3.2培养基[4]和茯砖茶水提物的药敏纸片制备[5]
牛肉膏汤：取牛肉膏3～5g、蛋白胨10g、氯化钠5g置三角瓶内，加入水1000mL，混合加热溶解，调pH至7.4～7.6，煮沸3～5min，冷却后用滤纸过滤，装于适当容器内，高压灭菌后置阴凉处备用。
琼脂培养基：首先将l000mL水煮沸，再向其中加入牛肉膏3～5g、蛋白胨10g、氯化钠5g、琼脂20～25g，继续加热促其溶解，并补足由于蒸发而失去的水分，调pH至7.4～7.6，以纱布过滤，分装于烧瓶或试管内，经高压灭菌后备用。
药敏纸片：将普通定性滤纸用打孔机打成若干圆形纸片，直径为6mm，置于干燥洁净的试管内，放入高压蒸气灭菌器中，经121.3℃，15～20min高压灭菌后，取出，放入干燥箱内进行干燥。然后取经干燥后的纸片一定数量，分别放入已制备好的茯砖茶水提物中，浸泡40min，取出吸足提取物的滤纸片于60℃干燥箱中烘干，即成药敏纸片，备用。
1.3.3试验菌活化培养、活菌计数和供试菌液的制备[6]
用接种环分别挑取大肠杆菌、沙门菌、金黄色葡萄球菌、链球菌、枯草杆菌和巴氏杆菌斜面培养物一环，移接到装有30mL牛肉膏汤、容量为100mL的三角瓶中，置37℃、200rmp下摇床培养12h，使菌种活化，置于4℃冰箱作为菌原液备用。
取上述活化的菌原液经一系列10倍稀释，然后选择连续的三个稀释度菌液，且每个稀释度需做三个以上的重复，分别取0.2mL加到已制备好的无菌琼脂培养基平板上，然后用无菌涂棒将菌液涂布整个平板表面，经37℃、24h培养，根据观察结果，选取菌落数小于200个/每平板的平板培养基结果进行计数。再按上公式计算出每毫升菌原液所含活菌总数。每毫升菌原液活菌数=同一稀释度重复平皿菌落平均数×稀释倍数×5。
由上述实验数据计算出各菌原液的菌液浓度，并将其稀释到105CFU/mL或106CFU/mL，作为供试菌液保存于4℃冰箱中。
1.3.4药敏纸片法抑菌试验[7]
分别将经过计数的细菌液体稀释至105CFU/mL或106CFU/mL，使各种培养物活细菌的数量接近，要求在该浓度下，细菌能长满整个培养皿且分布均匀。在制备好的琼脂培养基平板中涂布上述稀释菌液各0.1mL，涂布均匀，制成含菌平板，置37℃恒温箱中15min后取出，目的使琼脂表面干燥，待用。用无菌镊子夹取己制备好的药敏纸片，放在上述含菌平皿上，每平板上4片，置37℃恒温箱中培养24h，用游标卡尺测定抑菌圈直径，取4个重复的平均值。以抑菌圈直径(mm)作为茯砖茶提取物抑菌活性指标，直径越大抗菌活性越强。
1.3.5最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)的测定[8]
采用试管二倍稀释法。取无菌带塞试管15支，于第一管加入牛肉膏汤0.9mL，其余各管加入O.5mL。再于第一管加入中茯砖茶提取液(lg/mL)O.1mL并混合均匀，取O.5mL加入第二管，依次类推，至14管，然后于1～13管及15管加入稀释好的菌液O.5mL。14管为阴性对照，15管为阳性对照。37℃培养16h～18h。以不发生混浊变化的最小浓度判为最低抑菌浓度(minimalinhibitoryconcentration.MIC)。将所有完全清晰无细菌生长的试管分别接种于琼脂培养基平板，37℃培养，以菌落数不超过5个的最低浓度为最低杀菌浓度(minimalbactericidalconcentration.MBC)。
2结果与分析
2.1 六种细菌培养物菌落形成单位的测定
根据方法1.3.3测定六种细菌培养物菌落形成单位数，结果见表1。由表1可见，经37℃，24h的培养，六种细菌培养物活菌数从大到小依次为大肠杆菌?金黄色葡萄球菌?巴氏杆菌?沙门菌?链球菌?枯草杆菌。
表1试验菌培养物的菌落形成单位计数
Table1TheunitarycolonyamountoftestbacteriasCulture
菌种名称
Nameofbacterium
培养时间(h)
Incubationtime
稀释度
Dilution
菌落平均数
Theaveragecolony
活菌数(cfu/mL)
Viablecount
大肠杆菌
Escherichiacoli
24
10-6
264.67
1.33×109
24
10-7
29.67
24
10-8
2.33
沙门菌
Salmonella
24
10-6
89.67
4.78×108
24
10-7
9.67
24
10-8
1.00
金黄色葡萄球菌
Staphylococcusaureus
24
10-6
242.33
1.27×109
24
10-7
25.00
24
10-8
2.67
链球菌
Streptococcus
24
10-5
335.67
1.74×108
24
10-6
34.33
24
10-7
3.67
巴氏杆菌
Pasteurella
24
10-6
116.67
1.01×109
24
10-7
25.33
24
10-8
2.33
枯草杆菌
Bacillussubtilis
24
10-3
193.67
9.90×105
24
10-4
23.33
24
10-5
1.67
2.2药敏纸片法测定茯砖茶提取物的抑菌效果
根据方法1.3.4进行药敏片法抑菌试验。由表2可知，茯砖茶水提取物对不同细菌的抑制作用略有不同。茯砖茶提取液对金黄色葡萄球菌的抑菌效果最好，抑菌圈直径达到23.4mm，其次是大肠杆菌、沙门菌、链球菌、巴氏杆菌和枯草杆菌。其中对链球菌、巴氏杆菌和枯草杆菌的抑菌相对较差。由于抑菌圈直径的大小直接表明抗菌活性的大小，直径越大，抑菌活性越强。因此对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的抑制作用尤为明显。
表2药敏纸片法测定茯砖茶提取物的抑菌效果
Table2TheantibacterialeffectofFuzhuanTeaextractbysensitivityfilterpapermethod
菌种名称
Nameofbacterium
抑菌圈直径(mm)
Inhibitoryzonediameter(mm)
平行1
Paralleltest1
平行2
Paralleltest2
平行3
Paralleltest3
平行4
Paralleltest4
平均值Average
大肠杆菌
Escherichiacoli
20.0
20.0
21.0
19.0
20.3
20.0
21.0
21.1
20.5
金黄色葡萄球菌
Staphylococcusaureus
21.0
24.5
23.0
24.0
23.4
25.0
21.5
24.5
23.5
沙门菌
Salmonella
11.5
12.0
10.5
10.0
10.2
10.0
11.0
8.5
8.0
链球菌
Streptococcus
7.5
8.0
8.5
7.0
7.9
8.0
8.5
7.0
9.0
巴氏杆菌
Pasteurella
8.0
7.5
6.0
7.5
7.3
7.5
6.5
8.0
7.0
枯草杆菌
Bacillussubtilis
9.0
7.5
7.5
7.0
7.5
7.5
6.5
7.0
8.0
2.3测定茯砖茶提取物的最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)
表3茯砖茶对试验菌的MIC和MBC测定结果
Table4TheMICandMBCtestresultsofFuzhuanTeaforbacteria
菌种名称
Nameofbacterium
最低抑菌浓度(mg/mL)
MIC(mg/mL)
最低杀菌浓度(mg/mL)
MBC(mg/mL)
大肠杆菌
Escherichiacoli
12.5
25
金黄色葡萄球菌
Staphylococcusaureus
6.25
25
沙门菌
Salmonella
25
50
链球菌
Streptococcus
50
100
巴氏杆菌
Pasteurella
50
100
枯草杆菌
Bacillussubtilis
50
100
根据方法1.3.5测定茯砖茶提取液的最低抑菌浓度(MIC)，结果见表3。茯砖茶提取液对金黄色葡萄球菌的MIC值最小，为6.25mg/mL，其次是大肠杆菌、沙门菌、链球菌、枯草杆菌和巴氏杆菌。由于MIC值越小，其抑菌能力越强，所以茯砖茶提取液对金黄色葡萄球菌抑菌能力最强，而对链球菌、枯草杆菌和巴氏杆菌的抑菌能力相对较差。
根据方法1.3.5测定茯砖茶的最低杀菌浓度(MBC)，结果见表3。茯砖茶提取液对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的MBC值最小，为25mg/mL。因为MBC值越小，杀菌效果越好，杀菌能力相对也越强，所以茯砖茶提取液对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌对大肠杆菌的杀菌能力最强，对沙门菌杀菌能力次之，对链球菌、枯草杆菌和巴氏杆菌杀菌能力相对较差。
3讨论
从本次试验可以看出，茯砖茶提取液对金黄色葡萄球菌抑菌作用最强，其次是大肠杆菌、沙门菌，对链球菌、枯草杆菌和巴氏杆菌抑菌作用相对较弱。
提取物的体外抑菌强弱与提取物的成分和浓度有密切关系。大多数药用植物的水提取物浓缩到较高的浓度时，往往变得粘稠，这种提取物成分复杂，常含有生物碱、黄酮类、鞣质及没食子酸的衍生物、有机酸等多种抗菌、抑菌成分，也有蛋白质、淀粉、多糖、树脂等无抑菌作用的成分[9]。本试验所用茯砖茶的提取物，未作醇沉去除杂质，对各细菌的抑菌作用可能会有一定影响，显示仅对部分菌种有较强的抑菌作用。
茯砖茶中对人体具有保健效果的有效成分很多，如茶多酚类、咖啡碱、多糖、粗纤维、叶绿素、胡萝卜素、维生素B等。据有关文献记载，早在神农时期，茶就被用于杀菌消炎。其中茶多酚的主要用途：抗氧化、抑菌，特别对葡萄球菌、肠内细菌、肺炎杆菌、黄曲霉菌、金黄色链球菌等有显著的抑制作用[10]。另据有关文献报道，黄酮类化合物是药用植物的一大类有效成分，具有多种生物活性，其主要作用之一是抑菌或杀菌，低浓度能抑菌，高浓度能杀菌[11]。因此推测，茯砖茶抑菌的有效成分可能与茶多酚和黄酮类有关。
参考文献
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[10]宛晓春.茶叶生物化学[M].中国农业出版社.2003.8，328～329.
[11]俞佩芳.三种常见药物植物抗菌作用的探讨[J].华东师范大学学报(自然科学版)，1994，8(1)：89～93.
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