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茯砖茶中冠突散囊菌的代谢产物研究I冠突散囊菌的液体培养黄怀生1郑红发1粟本文1黄亚辉2
（1湖南省农业科学院茶叶研究所·长沙·410125；2华南农业大学园艺学院·广州·510642）
摘要：研究了茯砖茶中冠突散囊菌的液体培养和茶叶提取液培养，旨在研究茯砖茶中冠突散囊菌的代谢产物对茯砖茶品质形成机理及其对茯砖茶功能性成分的影响。
关键词：茯砖茶；冠突散囊菌；代谢产物；液体培养
茯砖茶制造过程中有一个独特工序就是发花，其目的是通过控制一定的温、湿度环境条件，促使微生物优势菌种的生长繁殖，产生大量金黄色的闭囊壳，俗称“金花”，金花的多少是鉴别茯砖茶品质好坏的标准。许多学者都对茯砖茶发花中优势菌种名鉴定作过研究[1～4]，大多认为此优势菌为冠突散囊菌。同时实验表明，茯砖茶品质形成过程中，微生物分泌的胞外酶，催化茶多酚氧化、缩合与蛋白质的分解、降解、碳水化合物的分解以及产物之间的聚合等系列反应。而对其代谢产物及代谢产物对茯砖茶功能性成分形成的贡献，尚未有系统的研究报道。因此对茯砖茶中冠突散囊菌的代谢产物进行系统研究，为揭开茯砖茶神秘功能提供理论基础。
1实验材料
1.1实验材料
1984年制茯砖茶，春茶（一芽一叶绿茶），马铃薯。
1.2仪器与化学药品
恒温培养箱，HZQ-QX摇床（哈尔滨东联电子技术开发有限公司），SP-DJ水平净化工作台（上海浦东物理光学仪器厂制造），艾科浦分析型实验室纯水机（重庆颐洋企业发展有限公司），琼脂，葡萄糖。
2方法
2.1冠突散囊菌分离
2.1.1培养基制作
将洗净后去皮的马铃薯100g，切碎，加水500ml，煮沸半小时，然后加葡萄糖（10g）和琼脂（5g），加热使琼脂完全熔化后，趁热用纱布过滤后分装锥形瓶，加棉花塞后灭菌，灭菌后取10ml倒入已灭菌好的培养皿中冷却。
2.1.2接种
待琼脂凝固后，在无菌工作台用接种圈刮下茯砖茶中金黄色菌放入盛有少量无菌水的小烧杯，轻轻搅拌，然后采用交叉划线法接种。
2.1.3培养
将接种好的培养皿放入恒温箱中培养4d，观察菌斑。
在第一次培养的基础上，再进行分离，得到比较纯的菌为止。
2.2冠突散囊菌液体培养基培养
培养基在2.1的基础上，不加琼脂，灭菌后直接进行接种。
接种：将分离纯化的冠突散囊菌，从培养皿中挖一小块加入锥形瓶中，密封好后放入摇床（28℃，130r／min）进行培养，1周后观察结果。
2.3冠突散囊菌茶叶提取液培养
取粉碎茶样5.0g放入500ml锥形瓶中，于水浴锅中沸水浸提45min，每10min摇动一次，浸提后脱脂棉过滤于500ml容量瓶，定容。然后分装入锥形瓶中灭菌。灭菌后进行接种培养，1周后观察结果。
2.4测定方法
茶多酚含量：用酒石酸铁比色法测定；氨基酸含量：用茚三酮比色法测定；咖啡碱含量：用紫外分光光度法。
3结果分析
3.1冠突散囊菌的分离
通过第一次分离得到12个菌斑（图1），其中9个为金黄色斑点，为冠突散囊菌菌斑，两个乳白色斑点，可能也是冠突散囊菌斑，为冠突散囊菌的繁殖前期菌丝体生长，尚未产生金黄色闭囊壳及分生孢子；一个绿色斑点，为杂菌斑点。斑点分离效果好，明显，能达到茯砖茶中冠突散囊菌的分离作用。
3.2分离菌的个体形态特征
对菌株进行插片培养，然后进行镜检（图2，3），发现该菌菌落由子囊果与菌丝组成；子囊果，即闭囊壳，呈球形或近球形，黄色，直径约150~200m；子囊果破裂释放子囊孢子，子囊孢子呈球形或近球形或双凸镜形，直径5m左右，有冠状突起，宽约0.8~1.0m；菌丝呈白色，直径约8~10m。菌株的个体形态特征与齐祖同[5]、温琼英[6]对冠突散囊菌鉴定
的特征相一致。
3.3冠突散囊菌的液体培养基培养
在平板培养基培养的基础上，不加入琼脂凝固，进行液体培养基培养（图4），在摇床（28℃，130r／min）中培养1周后，两个接种分离好的冠突散囊菌培养瓶中，均有冠突散囊菌菌落生长，且比较茂盛，菌落较多。说明，冠突散囊菌在此环境条件下能适应繁殖；同时也说明，摇床温度及转速参数设置，可以满足冠突散囊菌的液态培养。
3.4冠突散囊菌的茶叶提取液培养
不同茶叶提取液培养，对冠突散囊菌的繁殖影响不同，试验比较了6个茶叶样品提取液培养冠突散囊菌效果，第一次培养1~3号，培养液中均未有菌落的生长；第二次培养4~6号，结果表明（图5），其中6号样品中冠突散囊菌菌落生长良好，而4号和5号样品均未有菌落的产生，说明茶汤中生化成分影响了冠突散囊菌生长，从6个样品生化成分分析结果（表1），6号样茶汤中茶多酚：游离氨基酸：咖啡碱三项比值为10：1：1.5。但具体是哪种或者哪几种生化成分对其生长是促进或抑制作用，有待进一步研究。
4讨论
茯砖茶生产中一个关键核心的工序是“发花”，曾经以“发花”的茂盛度来评价茯砖茶品质的优劣，因而发花对茯砖茶品质的影响是相当大的；反之，茶叶中生化成分对“发花”即冠突散囊菌的生长也
有很大影响，因而，“发花”的茂盛度从某种程度来讲能反映出茯砖茶的品质。茯砖茶中功能性成分现有报道[7]认为，茯茶素是从茯砖茶中分离得到的具有显著降脂减肥和降糖功能的特异成分，是茯砖茶中独有的新活性物质。通过茶叶提取液培养来研究其代谢产物，以达了解茯砖茶中优势菌———冠突散囊菌对这一特异成分形成的影响，及与特异成分形成的机理关系的目的，这有待进一步深入研究。
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