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茯砖茶冠突散囊菌多样性初步研究摘要:从湖南的不同地区采得较具代表性的茯砖茶样品7种，分离纯化各样品中优势微生物“金花菌”。以广东微生物研究所鉴定确认的冠突散囊菌(Eurotiumcristatum)作为标准菌株，描述并比较各菌株平板培养下菌落大小、形状、颜色、质地等特征，以及电镜下有性型与无性型等生理结构的差异，并依据各菌株形态特征上的典型差异对它们予以初步命名。结果表明:七株菌株均属于冠突散囊菌，但在形态和在生理等特征上有四种却表现出较为明显的分化，可能属于冠突散囊菌的变型。本研究为冠突散囊菌多样性的鉴定与不同生理小种的命名提供了基础。关键词冠突散囊菌;不同类型;培养特征;电镜特征中图分类号:S571．1文献标识码:A文章编号:0577-8921(2012)02-082-07AstudyondiversityoftheEurotiumcristatuminFuzhuanbrick-teaHUZhiyuan1，2，ZHAOYunlin1，3，LIUShiquan1，3，LIYanzi3，XUYongli3(1．CollegeofFoodScienceandTechnology，HunanAgriculturalUniversity;2．CollegeofChemicalandEnvironmentalEngineering，HunanCityUniversity，HunanYiyang，413000，China;3．CollogeofBioscienceandBiotechnology，HunanAgriculturalUniversity，Changsha410128，China)Abstract:SevensamplesofFuzhuanteafromdifferentregionsoftheHunanprovincewereusedtoisolatemicroorganism"goldflower"，majormicroorganismwasidentiedisEurotiumcristatum．Diversityofmorphologicalcharacteristicsofthemicroorganismwerestudiedunderelectronicmicroscopy．TheresultsshowthatthereweresevenofEurotiumcristatum．KeywordsEurotiumcristatum;types;Cultivationcharacteristic;Electronmicroscopefeatures
引言茯砖茶属于黑茶类，以加工方法复杂、口味独特而著称。“发花”工序是形成茯砖茶品质的关键工艺，国家标准中规定特茯和普茯均应达到“发花普遍茂盛”的水平［1］，而“发花”过程的实质则是控制一定的温度与湿度，促使微生物在茶叶内大量繁殖以达到改善其品质的目的。对于发花过程中的微生物，先前茶叶学者们作过较多研究［2－10］，最终将优势微生物确认为冠突散囊菌(表1)。而据资料显示［11］，目前我国不同茶叶产区分离出来的冠突散囊菌有四种以上不同类型，是否属于原菌株的变种(型)或是亚种，还有待考证。本研究选取湖南地区不同产地的茯砖茶样品，分离纯化并保存其中冠突散囊菌，对各菌株形态特征的差异性进行探讨，并与冠突散囊菌标准菌株进行比较，以期为冠突散囊菌的地域性差异、不同生理小种的发现与命名提供实验基础，并为茯砖茶生产提供优质的菌种资源。1材料与方法1．1试验材料1．1．1不同茯砖茶样品从湖南益阳、安化、临湘、岳阳采取具有代表性的茯砖茶样品7种(表2)，并置于阴凉避光处保存。1．1．2冠突散囊菌标准菌株菌株GBZ1从金湘益牌茯砖茶(湖南益阳茶厂有限公司，2009)内分离获得，已由广东微生物研究所鉴定为冠突散囊菌(Eurotimcristatm)，无性型名称为小冠曲霉(Aspergilluscristatellus)，在本研究中选取GBZ1作为冠突散囊菌标准菌株。1．1．3主要药品与试剂NaCl、硝酸钠、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钾、硫酸亚铁、蔗糖、琼脂粉。1．1．4主要仪器设备恒温振荡仪(SHA-Ea)、单人超净工作台(SW-CJ-IFD)、恒温生化培养箱(LRH-250)、超低温冰箱(DW-FW251)、立式压力蒸气锅(LDZX-75KBS)、艾柯纯水机(AKSW-V-8)、磁力加热搅拌器、电子天平(FC104)、电子显微镜(JSM-6380LV)、中药粉碎机(GX-15A)。1．1．5培养基的选择(1)察氏培养基称取3g、氯化钾0．5g、硫酸镁(MgSO4·7H2O)0．5g、1g、硫酸亚铁0．01g、30g、琼脂20g、蒸馏水定容至1000mL，煮沸并搅拌均匀，高压灭菌备用。用于优势菌株的分离与培养。(2)C20培养基［12］提高蔗糖浓度到20%，其他配方与察氏培养基相同。用于各菌株的电镜制片观察。1．2试验方法1．2．1茶叶样品稀释平板培养将茶叶样品用中药粉碎机粉碎，称取粉碎后的样品25g，放置在含225mL无菌生理水与玻璃珠的500mL三角瓶内，盖上封口膜，在振荡仪上200r/min振摇30min，使其中微生物充分分散，制成10－1倍样品稀释液。在超净工作台上用梯度稀释法得到10－5倍样品稀释液，用移液枪取1mL该稀释液转到察氏平板上并用涂布器涂布均匀，放置在恒温箱内28℃静置培养，每个茶叶样品各设置4个重复。1．2．2冠突散囊菌的分离与纯化选择长有“金花菌”的平板，用接种针挑取长势较好的菌落，于察氏平板上进行划线分离，这样反复3～4次后获得纯培养的菌株，转接斜面，置于4℃冰箱内保存。1．2．3冠突散囊菌的平板培养与形态观察取4℃保存的菌株在常温下复苏24h后，三点式转接于察氏平板与C20平板，置于培养箱内28℃静置培养，每天观察菌落的生长情况并作好记录。1．2．4冠突散囊菌的扫描电镜观察挑取C20平板上生长到适宜大小的菌落制成标本并固定［13］，常规法制片后，在扫描电子显微镜下观察观察其菌丝、闭囊壳、子囊、子囊孢子、分生孢子头等形态并拍照。2结果与分析2．1各菌株的形态特征依据各菌株在察氏平板上的培养特征与电镜下闭囊壳、子囊孢子、分生孢子头与分生孢子的形态结构(图1－8)，得到表3、表4、表5。2．1．1冠突散囊菌标准菌株形态特征标准菌株GBZ1(图1)的形态特征为:察氏培养基上培养7d时菌落直径为21－24mm，菌落形状为较规则的圆形，菌落中央厚度略高于边缘，中心有小隆起。菌落结构较致密，边缘呈浅黄色，往中央颜色逐渐加深，由浅黄渐变为鹅黄，到菌落中央变为橄榄褐色。生长时间较长的部位有少许黑褐色香油状渗出液，菌落周围的培养基亦被色素染成茶褐色。生殖结构以闭囊壳为主，菌落边缘可见少量灰绿色分生孢子头。菌落老化后(14d)，直径达27－34mm，仍为较规则的圆形，菌落边缘变成铁锈色，中心为灰绿色，产生大量闭囊壳结构。其电镜下特征为:分生孢子头呈疏松放射形，孢子梗生自基质，长度140－300m，直径为6－10m，壁光滑;顶囊近球形或烧瓶形，直径12－25m;瓶梗6．5－10m×2．5－3．4m，着生于顶囊上半部。分生孢子呈椭球形，中心有凹槽，外壁粗糙具小刺，孢子体大小为4．4－5．0m×3．2－3．8m。闭囊壳为球形或近球形，直径110－160m;子囊为球形，10－14m;子囊孢子呈双凸镜形，有两个明显的纵向鸡冠状突起，孢子体大小为5－6m×4－5m，凸面比较粗糙，具尖疣。这与之前学者［6，9］对冠突散囊菌形态特征的描述基本相一致。2．1．2冠突散囊菌近似菌株菌株G1、G2(图2、图3)的平板形态与标准菌株相似度较高，其电镜下各结构特征也与标准菌株基本一致。2．1．3冠突散囊菌变型Ⅰ菌株G3(图4)与标准菌株大体相似。其差异之处为:老化的菌落较大，直径在32～45mm之间，且菌落形状不规则，边缘生长呈辐射状;菌落中心为铁锈色至红褐色，离菌落中心三分之二处有一条灰绿色晕圈。2．1．4冠突散囊菌变型ⅡG4(图5)生长速度与标准菌株接近。培养7d时，菌落直径在22～27mm之间，菌落形状接近球形，结构较致密，边缘为浅黄至鹅黄色，中心部位仍然呈橄榄褐色。与标准菌株区别为产褐色素较少，菌落鹅黄色区域所占面积较大;其子囊孢子体大小为5．6－6．4m×4．2－5．1m，比标准菌株略大，子囊孢子外壁上呈现较多不规则条纹，比标准菌株更为粗糙。2．1．5冠突散囊菌变型Ⅲ菌株G5、G6(图6、图7)与标准菌株差异较大。其生长速度较快，7d时菌落直径达25～39mm，形状为不规则球形，菌落中心有少量不规则褶皱，产褐色素均较少。成熟闭囊壳为球形或近球形，直径在140－190m之间，闭囊壳外壁较为光滑。其子囊孢子比标准菌株略小，大小在4．2－5．2m×3．7－4．4m之间。2．1．6冠突散囊菌变型ⅣG7(图8)菌落生长速度较快，7d时直径达26～31mm，形状为近球形，产生少量渗出液。其子囊孢子大小为5．4－5．8m×3．6－4．8m，与标准菌株相比更加扁平，孢子体双凸镜特征不够明显，其他特征与冠突散囊菌标准菌株基本一致。3讨论在当今真菌的分类学研究中，主要是以孢子形态与子实体形态特征为主要分类依据，同时参照细胞结构，生理生化和细胞特征等［14］。通过显微镜尤其是电子显微镜对其细胞构造、无性及有性生殖结构特点、孢子形状和颜色等的观察描述成为了真菌分类的可靠手段［15］。本研究从形态特征上对七株来自湖南不同地区的冠突散囊菌进行了详细描述与比较，为冠突散囊菌的多样性研究与优良菌种的筛选提供了实验基础。研究结果表明，七株实验菌株均基本符合中国真菌志［12］与Raper的专著［16］中对冠突散囊菌的描述，如子囊孢子都具有冠状的突起与粗糙具尖疣的表面、分生孢子壁具小刺、在察氏培养基上可正常生长等，由此可以鉴定七株菌株都属于冠突散囊菌。而包括GBZ1在内的八株菌株在形态特征上表现出四类较为明显的生理分化(表6)。其中G1、G2与标准菌株在形态特征上较为相似，其来源茯砖茶产自益阳和安化地区，说明较小的地理隔离并未使它们产生遗传上的差异。G3在培养形态上与GBZ1有一些差异，老化后的菌落周边呈辐射状蔓延，电镜下特征基本一致;G7的生长速度和子囊孢子形态与GBZ1有一定差异;G4、G5、G6与标准菌株的差异均较大，其中G4与标准菌株有3处差异，菌株来源茶叶为1979年产陈年茯砖茶，推测是在数十年的保存过程中，菌株发生了一定程度的变异;G5、G6与标准菌株有4处差异，其来源茯砖茶分别产自临湘与岳阳，可能是在地理隔离与不同生产环境的影响下，菌株基因发生改变从而导致形态特征上的差异。根据中国真菌志［12］对曲霉属变型的定义，菌株G3－G7极有可能属于冠突散囊菌原种的变型。为了便于之后进一步研究的开展，本研究依据形态特征上的典型差异对各个菌株予以初步命名:将G3命名为蔓延冠突散囊菌(EurotiumcristatumspreadZhao)、G4命名为鹅黄冠突散囊菌(EurotiumcristatumlightyellowZhao)、G5与G6命名为褶皱冠突散囊菌(EurotiumcristatumdrapeZhao)、G7命名为异冠冠突散囊菌(EurotiumcristatumvariecolorZhao)。对于冠突散囊菌种下各单位的进一步鉴定，如采用现代分子生物技术等，以及对其发酵产物安全性与生物活性的检测，还有待进一步探讨。参考文献1中华人民共和国国家标准:茯砖茶国家标准［S］．GB/T9833．3－88．2徐国帧．砖茶黄霉菌之分离．茶叶参考资料，1941，196－210．3邓冠云．紧压茶发酵产生“黄花”的探讨．茶叶，1981(03):45－48．4仓道平，温琼英．茯砖茶发酵中优势菌与有害菌类的分离鉴定．茶叶通讯，1981(2):12－14．5胡建程，胡月龄，钱泽树．茶叶中霉菌的研究．茶叶，1979(0l):8－9．6温琼英．茯砖茶中主要微生物的研究．茶叶通讯，1986(04):19－21．7宛晓春，茶叶生物化学［M］．北京:中国农业出版社，2003:271－274．8王志刚，童哲，程苏云．茯砖茶中霉菌含量和散囊菌鉴定及利弊分析．食品科学，1992，(05):1－5．9黄浩，刘仲华，黄建安．“发花”散茶中“金花”菌的分离鉴定．茶叶科学，2010，30(5):350－354．10刘作易，秦京．茯砖茶“金花”菌—谢瓦氏曲霉间型变种的袍子产生条件．西南农业学报，1991，4(1):73－77．11杨抚林，邓放明，赵玲艳等．黑茶微生物学研究进展．微生物学杂志，2006，26(1):81－84．12齐祖同．中国真菌志:第五卷:曲霉及相关有性型［M］．北京:科学出版社．1997．132株球形棕囊藻溶藻细菌的分离及鉴定．环境科学，2011(01):225－230．14邢来君，李明春．普通真菌学［M］．北京:高等教育出版社，1999，271．15杨苏声，周俊初．微生物生物学［M］．北京:科学出版社，2004．16RaperK，FennellD，AustwickP．TheGenusAspergillus［M］．Baltimore:Williams＆WilkinsBaltimore，1965．
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